UTILIZACIÓN DE TEJIDO ADIPOSO PROVENIENTE DE CIRUGÍAS ORTOPÉDICAS PARA LA OBTENCIÓN DE CÉLULAS ESTROMALES MESENQUIMALES PARA APLICACIONES EN MEDICINA REGENERATIVA: COMPARACIÓN DE MÉTODOS DE AISLAMIENTO
Resumen
Introducción: Las células estromales mesenquimales (MSC) se pueden aislar de diversos órganos, siendo la médula ósea una de las fuentes más destacadas para usos experimentales durante las últimas décadas. Estas poseen capacidad de diferenciación multipotente.
Con el objetivo de explorar otras fuentes de MSC aptas para obtener células con propiedades útiles en estrategias de medicina regenerativa, nos propusimos analizar al tejido adiposo cercano a las zonas de trauma en rodilla y muslo, como fuente alternativa a las MSC provenientes de médula ósea.
Materiales y métodos: Previa firma del consentimiento informado por parte del paciente y con la aprobación del protocolo de investigación por el Comité de Ética, se reclutaron 17 muestras de tejido adiposo de descarte. Estas provinieron de pacientes entre 18 y 65 años sin patologías previas, sometidos a cirugías ortopédicas no oncológicas de rodilla y muslo.
Se establecieron dos métodos de aislamiento: 1) mediante explanto; 2) mediante disgregación enzimática. Para 1), los fragmentos se incubaron adheridos a placas de cultivo en medio basal (Dulbecco´s Modified Eagle's Medium, DMEM baja glucosa) suplementado con 100 µg/ml penicilina, 10 µg/ml de estreptomicina, 0.25 µg/ml anfotericina (ATB), 1% (v/v) de L-Glutamina y 20% de suero fetal bovino (SFB). Para 2) los fragmentos se suspendieron en Colagenasa tipo I (0,1% en solución salina) a 37°C, en un agitador de manera continua durante 45 minutos. Luego de una centrifugación (400 x g, 12 minutos) el pellet con la fracción vascular estromal (SVF), se resuspendió en el mismo medio utilizado en 1), y se sembró en placas de cultivo para expansión. A partir de este punto, el procedimiento fue el mismo para 1) y 2): se procedió al primer pasaje de los cultivos (p1) cuando se alcanzó una confluencia del 75-90%. Se digirió el cultivo (tripsina 0,5%) y se sembró en placas a modo de incrementar el número de células. Durante cada sub-pasaje, una parte de las células continuó amplificándose y otra se congeló en viales con medio de criopreservación (10% dimetilsulfóxido- DMSO, 90% SFB), manteniéndose en tanques de Nitrógeno (N2, líquido, -196°C).
Resultados: En cuanto al 1), se pudo observar que las células adherentes de linaje mesenquimal obtenidas a partir del explanto, migraron desde este formando un patrón de “anillo” alrededor del fragmento, observable al microscopio. A diferencia de éste, por el método 2) se observó la adhesión de las células presentes en la SVF de manera aleatoria, y homogéneamente distribuídas en la superficie de las placas de cultivo.
Discusión: Las diferencias observadas en cuanto a velocidad de migración, de adhesión o de proliferación, en los cultivos obtenidas mediante 1) y 2), estarían asociadas a características de la muestra más que al método utilizado. Actualmente estamos evaluando si la edad, sexo y lugar anatómico de la extracción, están asociados a estas variaciones. Resultados preliminares permiten hipotetizar que cuanto más joven era el paciente, mayor era la proliferación celular. No se observaron cambios significativos en la comparación entre pacientes femeninos y masculinos.
Hasta el momento, el método 2) resultó ser más efectivo en términos de velocidad de adhesión celular, ya que en menos de 24 horas gran cantidad de células se adhirieron a las placas.
Conclusión: La disminución de donantes de médula ósea mediante punción de cresta ilíaca, y la morbilidad asociada a la técnica invasiva para el aislamiento de células residentes de la médula ósea del mismo paciente, generan la necesidad de explorar otras fuentes de MSC para estrategias de medicina regenerativa. La accesibilidad del tejido adiposo cercano al nicho óseo en pacientes bajo una resección quirúrgica ósea hacen de esta fuente una alternativa plausible.
